III. Analiza strukturalna
1. Przewidywanie struktury drugorzędowej białka na podstawie sekwencji aminokwasowej Sekwencja aminokwasowa to nie tylko ciąg następujących po sobie znaków. Warto pamiętać, że w praktyce oddziaływania występujące pomiędzy aminokwasami odległymi od siebie o więcej niż jedną pozycję są obecne i w ogromnym stopniu wpływają na kształt i funkcję poszczególnych białek. Dzięki poprzednim zadaniom znasz już kluczowe rejony w łańcuchu polipeptydowym badanego białka. Ponadto znane są już regiony konserwatywne wśród niektórych homologów. Następnie należałoby się zastanowić jaką funkcję rejony te pełnią w badanym białku. Kolejnym zadaniem będzie zatem próba przewidzenia drugorzędowej struktury badanego białka na podstawie jego sekwencji aminokwasowej oraz sekwencji aminokwasowych jego homologów.
a. Do przewidzenia struktury drugorzędowej w obrębie posiadanej sekwencji wykorzystaj program Jpred (http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/). Dodatkowo porównaj jak różnią się między sobą przewidywania z wykorzystaniem różnych technik.
b. Do pierwszego przewidywania wykorzystaj tylko sekwencję badanego białka.
c. Do drugiego sposobu wykorzystaj zapisane wcześniej w formacie FASTA przyrównanie sekwencji białka z jego 5 homologami. W tym celu zapisane w notatniku przyrównanie (w formacie FASTA) wczytaj do programu (opcja w ustawieniach zaawansowanych) i jako format wybierz FASTA.
d. Trzecim sposobem określenia struktury drugorzędowej dla badanej sekwencji będzie wykorzystanie dostępnych w bazie danych informacji na ten temat. W bazach danych PDB i ePDB dostępne są eksperymentalnie określone struktury białek. Przeszukaj ręcznie te bazy danych w poszukiwaniu odpowiedniej sekwencji i struktury lub wykorzystaj wbudowane w program JPred narzędzie, które automatycznie odsyła do odpowiednich struktur.
e. Stwórz tabelę zbiorczą z wynikami, w której umieścisz informacje na temat regionów łańcucha, dla których przewidziana została struktura drugorzędowa.
2. Budowanie modelu przestrzennego białka na podstawie posiadanej sekwencji aminokwasowej, w oparciu o eksperymentalnie określone struktury białek podobnych Jak wyżej w tekście zostało wspomniane, wysokie podobieństwo do siebie dwóch sekwencji aminokwasowych może świadczyć o wspólnym pochodzeniu obu białek jak również o podobnej strukturze trójwymiarowej. W przypadku, gdy dysponujemy sekwencją białkową, lecz nie znamy odpowiadającej jej struktury, możemy zastosować metodę modelowania przez homologię czyli wykorzystać znane struktury białek homologicznych do przewidywania trójwymiarowej struktury białka badanego. Jest to możliwe przede wszystkim dlatego, iż struktura 3D białka w toku ewolucji jest dużo lepiej zachowana niż odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa. Gorzej jeśli nie są znane żadne homologi badanego białka. W tym przypadku jednak można wykorzystać zjawisko konwergencji strukturalnej i do modelowania wykorzystać analogi strukturalne czyli białka, które nie są bezpośrednio spokrewnione z szukanym białkiem, lecz niezależnie osiągnęły zbliżoną do niego strukturę. Zjawisko jest to bardzo ciekawe i może być spowodowane m.in. korzyściami ewolucyjnymi, które wykazuje określona struktura.
Modelowanie struktury przestrzennej białka zostanie przeprowadzone na portalu SWISS-MODEL. Generalnie zbudowanie modelu w programie SWISS-MODEL składa się z 4 etapów:
Identyfikacja struktur(y), która(e) będą pełnić rolę matrycy
Przyrównanie sekwencji wyjściowej do wybranej struktury
Budowanie modelu
Ocena jakości modelu SWISS-MODEL umożliwia wykonanie procesu modelowania białka na kilka sposobów, m.in.:
automatyczny – program na podstawie podanej sekwencji w pierwszym etapie wyszukuje struktury, które mogą służyć jako matryca do utworzenia modelu, a następnie na podstawie określonych parametrów sam wybiera optymalną matrycę i na jej podstawie buduje model (opcja „Build Model”) 6 | 9
półautomatyczny – opcja ta różni się od poprzedniej tym, że wśród matryc wyszukanych przez program, użytkownik sam dokonuje wyboru, którą z nich wykorzystać do budowy modelu (opcja „Search For Templates”)
ręczny; tryb dopasowania (opcja „Target-Template Alignment”) – jeśli przed rozpoczęciem modelowania, wiemy z jakiej matrycy chcemy skorzystać (jej struktura musi być w bazie danych) to zamiast wprowadzania sekwencji, danymi wejściowymi może być wcześniej przygotowane dopasowanie sekwencji (np. z programu Clustal). UWAGA: Przyrównanie sekwencji w programie Clustal w tym przypadku musi być wykonane dla sekwencji badanej i sekwencji matrycy, której struktura dostępna jest w bazie danych (np. PDB). Ponadto w formacie FASTA w opisie sekwencji matrycy musi znaleźć się ID białka z bazy danych. W tym przypadku pomija się etap wyszukiwania matrycy oraz jego wyboru, gdyż jest ona zadana z góry przez użytkownika. Ponadto zaletą tej opcji jest możliwość budowania alternatywnych modeli i ich oceny, co w innym trybie mogłoby nie być możliwe. Jest to przydatne zwłaszcza w przypadku, gdy do modelu wykorzystuje się białka o podobnych strukturach lecz wyraźnie różnych sekwencjach.
W tym celu posiadaną sekwencję białka wklej w odpowiednie pole i wybierz „Search For Templates”. Jeśli badane białko jest heterooligomerem, możesz wprowadzić sekwencje dla wszystkich unikalnych łańcuchów aminokwasowych poprzez wybór opcji „Add Hetero Target”. b. Wśród wyników zaznacz te struktury, które posłużą jako matryca do zbudowania modeli (każda zaznaczona struktura posłuży jako odrębna matryca dla odrębnego modelu). Podczas wyboru matrycy kieruj się kluczowymi parametrami takimi jak:
GMQE (Global Model Quality Estimation) – parameter oparty na wynikach dopasowania sekwencji wyjściowej z sekwencją wybranej struktury Struktura czwartorzędowa struktury – znajomość podjednostek tworzących badane białko pomoże w wyborze odpowiedniej matrycy (w razie wątpliwości danych szukać w bazie PDB)
Skład ligandów
Metoda (najlepiej krystalografia rentgenowska o jak najlepszej rozdzielczości)
QSQE (Quaternary Structure Quality Estimation) – parametr określający stopień dopasowania pomiędzy regionami podjednostek, które są ze sobą w kontakcie. Wartość powyżej 0.7 jest uznawana za rzetelną.
Ponadto zakładki: Quaternary Structure, Sequence Similarity i Alignment of Selected Templates.
d. Następnie model zapisz w formacie PDB i zachowaj do następnych zajęć. Dla pewności sprawdź czy plik otwiera się w programie PyMol lub USCF ChimeraX.
e. Analogicznie zbuduj kolejny model dla zmutowanej wersji białka. W tym celu ręcznie w sekwencji białka, w odpowiednim miejscu zamień aminokwas formy dzikiej na aminokwas formy zmutowanej. Tak zmienioną sekwencję wykorzystaj do zbudowania modelu. Po zbudowaniu modelu, zapisz go w formacie PDB i wraz z poprzednim modelem zachowaj do następnych zajęć.